ÈESKÁ UROLOGIE / CZECH UROLOGY – 4 / 2017

292 Ces Urol 2017; 21(4): 289–298 ORIGINÁLNÍ PRÁCE èení apoptotických spermií byl použit v rùzných publikacích (8, 9, 10), ale nebyla v nich navržena fyziologická hranice. Fyziologická hodnota životnosti (tj. poèet PI– bunìk) odpovídá normì nastavené napø. pro histologické barvení eosinem tj. >58 % (PI–) sper- mií (3). Pøi použití dvou reagencií souèasnì (AN a PI) však rozlišujeme dvì populace bunìk v rámci PI– spermií. Pro živé a èasnì apoptotické spermie bylo nutné nastavit hranièní hodnotu. Nejprve jsme spoèítali prùmìrnou hodnotu èasnì apoptotických spermií u skupiny 20 mužù normozoospermikù (s vitalitou vyšší než 58 %, fragmentací DNA nižší než 20 %, ve vìku 26–50 let). Prùmìrný poèet èasnì apoptotických spermií (AN+ PI–) byl 8 % (rozmezí hodnot 2,5–15,6). Tuto hodnotu jsme odeèetli od 58 % (životnost znaèená pouze PI). Fyziologická hodnota pro živé spermie (AN– PI–) byla nastavena na >50 %. Stanovení integrity akrozomu Vzorek ejakulátu jsme zpracovali podle instrukcí uvedených ve SpermFlowEx ® kitu (Exbio Pra- ha, a. s.). Principem metody je vazba intra­ akrozomální protilátky Hs-8-FITC na proteiny pøítomné v akrozomu. Vazba protilátky probìh- ne, pokud je akrozom prostupný (má nízkou integritu membrány). Fyziologická hodnota je <30 % spermií. Stanovení poètu spermií s fragmentovanou DNA metodou TUNEL (terminal deoxynucleotidyl trans- ferase dUTP nick end labeling) Ejakulát jsme zpracovali dle postupu uvedeném v soupravì Apo Direct TM (Phoenix Flow Systems). Principemmetody je specifická vazba fluorescenè- nì znaèeného deoxyuridine trifosfátu (f-dUTP) na 3’- OH konce jednovláknové i dvouvláknové DNA (11, 12). Specifickou vazbu f-dUTP na fragmenty DNA katalyzuje enzym terminální deoxynukleo- tidyltransferáza. Po zmìøení vzorku v prùtokovém cytometru jsme hodnotili zastoupení spermií s na- vázaným f-dUTP. Fyziologická norma pro fragmen- taci DNA stanovená metodou TUNEL je <20 % spermií (11, 12). Obr. 1. Stanovení apoptotických spermií prùtokovou cytometrií v ejakulátu normozoospermikù. Annexin V – FITC (AN) a propidium jodid (PI) byly použity k rozdìlení bunìk na živé spermie (AN-PI-), èasnì apoptotické spermie (AN+ PI–), mrtvé a pozdnì apoptotické spermie (PI+). Fyziologická hodnota je >50 % živých spermií v ejakulátu. Vlevo – ApoHigh vzorek, Vpravo – ApoLow vzorek Fig. 1. Flow cytometry analysis of apoptotic sperm in normozoospermic semen. Annexin V-FITC (AN) and propidium iodide (PI) were used to discriminate the viable sperm (AN+ PI–), early apoptotic sperm (AN– PI–) and necrotic plus late apoptotic sperm (PI+) in flow cytometry analysis. The physiological value is >50 % viable sperm in semen. Left – ApoHigh sample, right – ApoLow sample