ČESKÁ UROLOGIE / CZECH UROLOGY – 1 / 2019

38 ORIGINÁLNÍ PRÁCE Ces Urol 2019; 23(1): 36–42 zvýšit diagnostickou sílu cytologického vyšetření, podobně jako tomu je v histopatologii (8). Dosud však hraje v cytologické diagnostice uroteliálních nádorů jen okrajovou roli. V naší studii chceme ověřit možnosti použití imunocytochemického vyšetření vybraných mar‑ kerů v materiálu získaném cytocentrifugací a zpra‑ covaném metodou cytobloků. S vědomím limitů konvenční cytologie a cytobloku (tj. předevšímnízké buněčnosti) (9) jsme se v první fázi rozhodli korelovat výsledky imunocytochemického vyšetření cytoblo‑ ků a imunohistochemického vyšetření tkáňových vzorků resekovaného nádoru u stejných pacientů. Na základě rešerše literatury jsme pro studii po‑ užili markery Ki-67, MCM2, MCM5 a p53. Ki-67 je jaderný protein, marker buněčné proliferace. U kar‑ cinomu močového měchýře jeho zvýšená exprese koreluje s horším přežitím a vyšší mírou rekurence (10). MCM2 a MCM5 jsou jaderné proteiny, které se účastní buněčné proliferace. Exprese těchtomarkerů může zlepšit detekci uroteliálního karcinomumočo‑ vou cytologií (11, 12, 13). P53 je tumor supresorový gen, jehož mutaci lze nepřímo imunohistochemicky detekovat v nádorové tkáni (10, 14). MATERIÁL A METODIKA Studijní soubor Do studie bylo zařazeno 77 pacientů, u kterých bylo dostupné cytologické vyšetření vzorku moči odebrané před chirurgickým výkonem s optimálně celulárním cytoblokem (9) a histologické vyšetření resekovaného tumoru (25 pacientů s histologickou diagnózou low‑grade (LG) uroteliálního karcinomu a 52 pacientů s histologickou diagnózou high‑grade (HG) uroteliálního karcinomu). Histologické vyšetření Tkáně byly po makroskopickém popisu a zpra‑ cování zality do parafinových bloků. Řezy z parafino‑ vých bloků byly obarveny hematoxylinem‑eosinem a další řezy byly použity pro imunohistochemické vyšetření. U každého vzorku byl stanoven typ ná‑ doru, grade a stadium. Použita byla WHO klasifikace 2016 (15). Příprava cytospinových preparátů a cytobloků Z každého vzorku moči byly cytocentrifugací (10 min., 1 000 ot./min.) připraveny dva preparáty, které byly po zaschnutí obarveny technikou May‑Grünwald‑Giemsa‑Romanowsky. Cytobloky byly připraveny plazma‑trombinovou metodou. Po centrifugaci vzorkumoči (10min., 1000 ot./min.) a slití supernatantu byla k sedimentu při‑ dána krevní plazma s trombinem, aby se vytvoři‑ la kohezivní peleta, která byla dále zpracována ve tkáňovémprocesoru. Z cytobloku byl připraven řez barvený hematoxylinem‑eosinem a další řezy pro následnou imunocytochemickou analýzu. Cytolo‑ gický nález v cytospinech a cytobloku byl klasifiko‑ ván podle PAP klasifikace a Pařížského systému 2016. Imunocytochemické a imunohistochemické vyšetření Imunochemické vyšetření bylo provedeno na řezech z cytobloku a tkáňového bloku. Řezy byly po deparafinizaci, blokování endogenní peroxidázy 3% roztokemH 2 O 2 a demaskování antigenů inkubovány s primárními protilátkami (Tab. 1). K detekci byl použit kit Mouse/Rabbit PolyDetector HRPwithDAB (BioSB, Santa Barbara, CA, USA). Hodnotili jsme pozitivní reakci protilátek v já‑ drech epitelových buněk (síla pozitivity 2+ a 3+ na škále 0 až 3+); ve tkáňových vzorcích jsme určili procentuální zastoupení pozitivních buněk, v cy‑ toblocích jsme zjišťovali počet pozitivních buněk v deseti sousedících zorných polích (zvětšení 400×). Statistická analýza Pro testování rozdílu exprese jednotlivýchmarke‑ růmezi low‑grade a high‑grade, pro cytobloky i tkáň, Tab. 1.  Přehled použitých primárních protilátek Tab. 1. An overview of used primary antibodies protilátka výrobce ředění Ki-67 Dako, Santa Clara, CA, USA 1 : 150 p53 Dako, Santa Clara, CA, USA 1 : 50 MCM2 Abcam, Cambridge, United Kingdom 1 : 300 MCM5 Abcam, Cambridge, United Kingdom 1 : 100