74 / 100
320
Ces Urol 2016; 20(4): 317–325
ORIGINÁLNÍ PRÁCE
Test na integritu chromatinu ve spermiích
(SCSA)
Metodaměří citlivost DNA spermií k denaturaci v ky‑
selémprostředí. Po obarvení akridinovou oranží (AO)
je na průtokovém cytometru s pomocí speciálního
softwaru stanoven rozsah denaturace DNA
in situ
měřením posunu barevného spektra od zelené
fluorescence (AO interkalovaná do dvouřetězcové
intaktní DNA) k červené fluorescenci (AO asociovaná
s denaturovanou jednořetězcovou DNA). Procento
červeně obarvených spermií neboli
fragmentační
index DNA (DFI)
pak vyjadřuje množství spermií
s fragmentovanou DNA a/nebo defekty protamínů
(5, 10). Uvádí se, že DFI >30% znamená velmi nízký
fertilizační potenciál a předurčuje pacienta pro tech‑
niky asistované reprodukce (14).
Test disperze chromatinu ve spermiích
(SCD, Halosperm)
Halosperm je jednoduchý test, který umožňuje
určit fragmentaci DNA spermií bez náročného
laboratorního vybavení. Metoda je založena na
disperzi chromatinu spermií v kyselém prostředí.
Po odstranění jaderných protaminů v lyzačním
roztoku a obarvení vykazují spermie s intaktní DNA
rozsáhlé rozvolnění smyček DNA, které pronikají
poškozenou membránou na povrch buňky, kde
vytvářejí tzv. „halo efekt“ kolem hlavičky spermie.
Fragmentovaná DNA se zobrazuje s malým nebo
žádným halo efektem, jelikož neproniká membrá‑
nou a zůstává uzavřená v hlavičce spermie (15).
Pokud více jak 30% spermií vykazuje fragmentova‑
nou DNA, vzorek je považován za abnormální (16).
Cílemnaší studie bylo (1) zavést kometový test pro
hodnocení integrity DNA ve spermiích, (2) stanovit
toutometodou hladiny poškození DNA ve spermiích
kontrolních jedinců a pacientů s poruchami plodnosti
a (3) porovnat výsledky získané kometovým testem
a komerčně dostupným kitemHalosperm.
MATERIÁL A METODY
Vzorky semene
Vzorky semene poskytli muži vyšetřovaní v Centru
reprodukční medicíny a reprodukční genetiky Ústa‑
vu biologie a lékařské genetiky 2. LF UK a FN Motol
a na Urologické klinice 2. LF UK a FN Motol. Vzorky
byly získány masturbací po třídenní abstinenci a po
zkapalnění při pokojové teplotě byly dále vyšetřeny
standardními postupy, jako je objem ejakulátu, kon‑
centrace, morfologie, vitalita a motilita spermií (17,
18), a metodami na stanovení fragmentace DNA ve
spermiích, tj. kometovým testem a Halospermem.
Všichni účastníci studie podepsali informovaný
souhlas se zařazením do studie a vyplnili dotazník
zaměřený na faktory, které by mohly ovlivnit kvalitu
semene (19). Jak informovaný souhlas, tak dotazník
byly schváleny Etickou komisí FN v Motole.
Celkem bylo vyšetřeno 98 mužů, kteří byli roz‑
děleni do tří skupin. Kontrolní skupina zahrnovala
muže vyšetřované pro infertilitu páru s prokázaným
ženským faktorem infertility nebo s normálními
hodnotami všech sledovaných parametrů při kon‑
venční analýze semene a jedno vyšetření na vlastní
žádost. Druhou skupinou byli muži vyšetřovaní
pro infertilitu. Do třetí skupiny byli zařazeni muži
s cévními poruchami mužských pohlavních orgánů
(MPO) – varikokélou.
Kometový test
K přípravě preparátů jsme modifikovali alkalickou
verzi kometového testu podle Schmida a kol. (12),
tj. po působení lyzačního roztoku (1 hod.) byly
preparáty ovlivněny DTT v lyzačním roztoku (0,154
g DTT/100 ml lyzačního roztoku) po dobu 10 min.,
následovala alkalické denaturace v elektroforetic‑
kém pufru (20 min. při 4°C), desetiminutová elek‑
troforéza (1,2 V/cm, 300 mA), 2x neutralizace 1 ml
Trisu po 5 min., barvení 100 μl roztoku GelRed (1 μl
GelRed/3 ml H
2
O; 30 min.) a promytí destilovanou
H
2
O (6 min.). Po fixaci 50 μl methanolu se prepa‑
ráty nechaly uschnout na suchém, tmavémmístě.
Z každého vzorku byly připraveny dva preparáty
podle již dříve popsaného postupu (20). Před hod‑
nocením byly preparáty zvlhčeny destilovanou H
2
O
a přikryty krycím sklem.
Měření poškozené DNA bylo prováděno po‑
mocí fluorescenčního mikroskopu BX51 (Olympus,
Japonsko) propojeného s kamerou CCD-1300B (VDS,
Vosskuhler, Německo) a obrazovou analýzou Lucia
Comet Assay 7,00 (Laboratory Imaging, ČR). Stupeň