44 / 84
284
Ces Urol 2015; 19(4): 281–290
ORIGINÁLNÍ PRÁCE
dia 80% konfluence a cytostatika byla aplikována
ve výsledných koncentracích odpovídajících 1000x
ředění u cisplatiny (Cisplatin Hospira 0,5 ml/ml,
Cisplatinum, Hospira UK Limited) a metotrexátu
(Metotrexate Hospira 25ml/ml, Metotrexatum, Hos‑
pira UK Limited) a 10 000x ředění u doxorubicinu
(Doxorubicin Teva 2 mg/ml, Doxorubicinum hydro‑
chloridum, Teva Pharmaceuticals ČR), gemcitabinu
(Gemcirena 38 mg/ml, Gemcitabini hydrochloriu‑
dum, Fresenius Kabi) a vinblastinu (Vinblastin Teva
1mg/ml, Vinblastini sulfas, Teva Pharmaceuticals ČR)
(tabulka 1). Po kultivaci 96 h byly buněčné kultury
fotograficky dokumentovány prostřednictvím zob‑
razovacího systému Olympus IX81 – CellR, jak bylo
předešle popsáno (13).
Stanovení cytotoxicity
in vitro
pomocí
hodnocení funkce mitochondrií (MTT)
Pro stanovení viability buněk v prostředí různých
koncentrací cytostatik byl použit test funkce mi‑
tochondriálních dehydrogenáz. Na 96jamkovou
destičku s rovným dnem (TPP, Switzerland) bylo
nasazeno 7 000 buněk/jamku v celkovém objemu
200 µl média/jamku. Buňky byly kultivovány 24 h
ve standardním CO
2
inkubátoru při 37°C s 95%
vlhkostí a 5% saturací oxidem uhličitým (Sanyo,
Japonsko). Po 24 hodinách bylo k buňkám přidáno
20 µl roztoku cytostatika (Doxorubicin, Metotrexát,
Vinblastin, Cis Pt, a Gemcitabin) v sestupných kon‑
centračních řadách (Stock a následné ředění vždy
10x, tabulka 1) a jamky byly opatrně propipetová‑
ny (tabulka 1). Ovlivněné buňky byly kultivovány
48 hodin s následným provedením MTT testu. Po
48 hodinách bylo k buňkám přidáno 20 µl žlutého
MTT roztoku (3-(4,5-Dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphe‑
nyltetrazolium bromide, Sigma) v koncentraci 5 mg
soli/ml PBS a kultivační destička byla ponechá‑
na 2,5 h v inkubátoru při 37 °C přikrytá alobalem.
Poté bylo médium s cytostatiky opatrně odsáto
a vzniklé fialové krystaly byly rozpuštěny přidáním
200 µl rozpouštědla (DMSO:absolutní etanol – 1:1)
a ponechány za mírného protřepávání v alobalu
při laboratorní teplotě 30 minut. Ke kvantitativ‑
nímu vyhodnocení MTT testu jsme využili meto‑
du absorpční spektrofotometrie (Tecan GENios,
software X Fluor 4.51) při vlnové délce λ=490 nm.
Jako pozadí sloužilo samotné rozpouštědlo a jako
pozitivní kontrola a tedy 100% životaschopnost
buněk byly brány jamky bez ovlivnění cytostatikem.
Měření byla provedena minimálně v triplikátech.
Pro vybrané koncentrace testovaných látek lze
sestavit koncentrační závislost viability, kterou v lo‑
garitmickémměřítku reprezentuje sigmoidní křivka.
Výsledné naměřené hodnoty absorbancí dvou sou‑
borů byly zhodnoceny pomocí neparametrického
Mann-Whitney U testu pro hladinu významnosti
α=0,05. Tento pořadový test vyhodnotil statistickou
významnost rozdílu mediánů dvou souborových
hodnot, tedy hodnot absorbancí pro linii BC44
a linii BC44DoxoR.
VÝSLEDKY
Podařilo se nám ustanovit dceřinou buněčnou linii
BC44DoxoR za pomocí kultivace ve vzrůstající kon‑
centraci doxorubicinu během několika měsíců. Tuto
linii jsme podrobili sérii testů, kde jsme ověřovali její
Tab. 1.
Výsledné koncentrace použitých cytostatik v jednotlivých ředěních použitých při analýze
Table 1.
Final concentrations of cytostatics at variable dilutions used
Cytostatikum
µg/ml
ředění
mg/ml
Stock
10x
100x 1000x 10000x 100000x 1000000x
Cisplatina
0,5
500
50
5
0,5
0,05
0,005
0,0005
Doxorubicin
2
2000
200
20
2
0,2
0,02
0,002
Gemcitabin
38
38000
3800
380
38
3,8
0,38
0,038
Metotrexát
25
25000
2500
250
25
2,5
0,25
0,025
Vinblastin
1
1000
100
10
1
0,1
0,01
0,001